“AGROBAKTERIUM DAN GEN GUN”

Tanaman transgenik pada umumnya dibuat dengan cara memasukkan gen yang diinginkan (gene of interest) kepada tanaman tertentu (Arabidopsis, padi, jagung, tomat, kedelai, dan lain-lain). Namun perlu dicatat bahwa memasukkan suatu gen ke dalam tanaman bukanlah serta merta seperti menyuntikkan obat kepada orang yang sakit, namun memerlukan perantara. Salah satu perantaranya adalah Agrobakterium, yaitu bakteri tanah yang menyebabkan tumor pada tanaman  . Meskipun ada banyak galur Agrobakterium, sampai saat ini hanya Agrobacterium tumefaciens yang digunakan untuk perantara transfer gen pada tanaman.

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah yang dapat menyebabkan penyakit tumor pada beberapa tanaman. Bakteri menginfeksi melalui bagian yang luka pada batang tanaman dan mengakibatkan tumor pada daerah sekitar akar dan batang tanaman. Penyebab pembentukan tumor bukan berasal dari bakteri itu sendiri tetapi dari plasmid yang dikenal dengan plasmid Ti. Ukuran DNA plasmid Ti cukup besar, berkisar antara 140-235 kb (1 kb = 1000 pasang basa). Selama menginfeksi, sebagian kecil dari DNA plasmid Ti (15-30 kb), disebut T-DNA, ditransfer kedalam inti sel tanaman dan tersisipi kedalam DNA inti sel tanaman. Dari sini T-DNA sudah terintegrasi dan stabil terpelihara dalam genom sel.

T-DNA membawa gen yang bertangung jawab terhadap pembentukan tumor dan sintesa asam amino yang dikenal sebagai opine. Opine digunakan sebagai sumber karbon dan nitrogen untuk menginduksi strain Agrobakterium. Strain-strain Agrobacterium dapat digolongkan berdasarkan jenis opine yang disintesa. Jenis opine yang umum adalah oktopine dan nopaline.

Gen-gen yang bertanggung jawab untuk transfer T-DNA juga terdapat dalam plasmid Ti yang disebut gen-gen virulen (gen vir). Infeksi Agrobakterium memerlukan jaringan tanaman yang luka karena gen vir dapat terinduksi oleh senyawa fenolik yang dilepaskan ole sel-sel tanaman yang terluka. Bagian dari plasmid Ti yang ditransfer dan terintegrasi kedalam genom tanaman adalah potongan T-DNA yang dibatasi oleh batas (border) kiri dan kanan (Gambar J-10.2). Daerah ini merupakan potongan DNA berukuran relatif pendek berisi urutan 25 pasang basa yang berulang. Setiap potongan DNA yang tersisipi diantara kedua batas T-DNA akan ditransfer dan diintegrasikan kedalam genom tanaman. Oleh karena itu plasmid Ti merupakan vektor yang sangat cocok untuk mengintroduksi gen-gen asing ke dalam tanaman.

Sebelum vektor plasmid Ti digunakan untuk mentransfer gene asing, maka gen-gen yang akan mengekspresikan pembentukan tumor harus dinon-aktifkan atau dibuang. Plasmid Ti yang sudah tidak mempunyai gen penyebab tumor disebut vektor ”dis-armed”. Sel-sel tanaman yang sudah terinfeksi plasmid tersebut tidak akan menghasilkan tumor dan akan menjadi tanaman normal.

Transformasi Gen ke Agrobakterium

Yaitu dengan cara bahwa gen (plasmid DNA hasil kloning) harus dimasukkan dulu (transformasi) ke Agrobakterium sebelum ditransfer ke tanaman. Ada dua cara yang digunakan untuk transformasi ke Agrobakterium, yaitu dengan metode electrophoration atau heat shock. Namun kali ini, akan dijelaskan dengan cara heat shock. Seperti biasa, sebelum transformasi, kita harus membuat sel kompeten dulu. Cara membuat sel kompeten Agrobakterium galur GV3101 sama dengan cara membuat sel kompeten untuk E. coli Namun ada sedikit perbedaan, yaitu:

1. Media yang digunakan, untuk Agrobakterium medianya adalah YEP
2. Antibiotiknya, yang dimaksud di sini adalah endogenous antibiotik yang dibawa oleh galur tertentu dan tidak dimiliki oleh galur lainnya. Untuk GV3101, antibiotiknya adalah gentamycin.

Sedangkan tahapan transformasinya sama persis dengan transformasi metode heat shock pada E. coli Yang berbeda adalah media-nya yaitu YEP plate agar. Selain itu Agrobakterium adalah mikroba yang memiliki pertumbuhan lebih lambat dari pada E. coli, sehingga inkubasinya membutuhkan waktu selama 48 jam (2 hari).

Ada 2 galur Agrobakterium yang biasa dipakai untuk transfer gen. Yang pertama yaitu GV3101. Galur ini biasanya dipakai untuk transfer gen pada tanaman model Arabidopsis. Ada kemungkinan juga bisa dipakai pada tanaman dikotil lainnya yang satu family dengan Arabidopsis. Galur lainnya adalah LBA 4404, yang biasa dipakai untuk transfer gene pada tanaman padi, jagung, atau tanaman monokotil lainnya. Perlu diingat juga bahwa metode transformasi gen pada tanaman adalah sangat spesifik artinya setiap species tanaman memiliki cara yang unik dan berbeda dengan tanaman lainnya. Misalnya untuk tanaman Arabidopsis, metode yang digunakan adalah floral dip (1), sedangkan untuk padi menggunakan metode callus transformation (2). Transformasi gen ke tanaman memiliki arti memasukkan gen (gene of interest) yang telah diisolasi ke tanaman tertentu melalui bantuan Agrobakterium. Jadi tahapannya jelas, yaitu setelah tahapan kloning selesai dan klon telah ditransformasi ke Agrobakterium.

Kali ini akan dijelaskan bagaimana caranya melakukan transformasi pada tanaman Arabidopsis.

Untuk Arabidopsis, ada dua cara yang sampai saat ini masih terus dipakai di sebagian besar laboratorium bioteknologi tanaman, yaitu: floral dip (1,2) dan spray (3). Meskipun masing-masing metode memiliki kelebihan dan kelemahan, namun keduanya memiliki efisiensi yang sama. Floral dip biasanya dipakai jika pada saat transformasi hanya menggunakan tidak lebih dari lima macam konstruk yang berbeda. Sedangkan untuk transformasi dengan konstruk yang berjumlah puluhan pada saat yang bersamaan, maka pilihan terbaik adalah menggunakan metode spray. Satu hal yang perlu dicatat adalah, meskipun metode spray mudah, namun perlu waspada dengan cross contamination pada saat melakukan transformasi.

Berikut tahapan bagaimana melakuan transformasi pada tanaman Arabidopsis:

1. Inokulasikan Agrobakterium (biasanya strain GV3101) yang telah mengandung konstruk tertentu pada 5 mL media YEP atau LB (dengan antibiotik yang sesuai, misal: Gentamycin, Rifampicin, Kanamycin) selama semalam (overnight) pada suhu 28 atau 30 derajat celcius.
2. Transfer overnight culture pada 500 mL YEP atau LB media dengan antibiotik yang sesuai, lalu inkubasikan pada suhu 28 atau 30 derajat celcius selama 8 atau 9 jam.
3. Sentrifuse sel dengan kecepatan 6000 rpm, selama 10 menit pada suhu 4 derajat celcius.
4. Buang supernatan dan resuspend dengan media MS (tanpa diautoclave), tentukan OD600 = 0.7-0.8.
5. Tambahkan Helper (Vac-IN-STUFF, atau Silwett) sebanyak 20 microliter per 100 mL volume culture. Mix.
6. Lanjutkan dengan transformasi (floral dip).
7. Caranya dengan cara dipping (menenggelamkan) bunga selama 10 sampai 20 detik.
8. Ulangi dipping sampai 3 atau 4 kali.
9. Rebahkan tanaman selama 2 hari dalam kondisi gelap.
10. Tegakkan lagi, dan tumbuhkan seperti biasa sampai menghasilkan biji.
11. Panen biji dan lanjutkan dengan seleksi biji yang mengandung gen yang telah dimasukkan.
12. Catatan: persiapan untuk metode spray sama, cuman nomor 6 digantikan spray.

“GEN GUN”

Latar Belakang:

Gen gun diciptakan sebagai cara baru untuk transformasi gen. Hal ini dirancang oleh John Sanford di Cornell University pada tahun 1987dan disisipkan materi genetik baru ke dalam sel tanaman sehingga jauh lebih mudah daripada metode sebelumnya, seperti penggunaan virus atau agrobacterium. Pistol gen memiliki berbagai kegunaan dan dapat digunakan pada banyak organisme seperti bakteri, ragi, dan garis sel mamalia, terutama yang sebelumnya telah sulit atau tidak mungkin untuk transfect seperti sel primer. Transformasi tidak hanya berlaku untuk organisme uniseluler, tetapi juga seluruh objek seperti daun atau binatang seluruh: (. Wetterauer, Brigit et al) Drosophila dan tikus. Telah sangat berguna untuk kloroplas juga karena tidak ada bakteri atau virus yang diketahui menginfeksi kloroplas dan metode ini telah memungkinkan cara untuk memperkenalkan DNA asing ke dalam kloroplas.

Ada tiga metode umum dari rekayasa genetik: metode plasmid, metode vektor, dan metode (gen gun) biolistic. Yang paling terkenal dari tiga adalah metode plasmid, yang umumnya digunakan untuk mengubah mikroorganisme seperti bakteri. Metode vektor mirip dengan metode plasmid, namun produk dimasukkan langsung ke dalam genom melalui vektor virus. Metode ketiga adalah metode biolistic yang akan dibahas secara rinci di bawah.  Lihat Tabel ini membandingkan efisiensi metode transfeksi seperti retrovirus, adenovirus, injeksi liposom, DNA langsung, dan metode biolistic. Efisiensi dari sistem senjata gen bervariasi, dengan sel-sel kulit menunjukkan serapan terbesar 10-20% (Yang, 1990). Sistem ini telah menggunakan modern dan telah digunakan untuk menyampaikan suatu asam berbasis vaksin hepatitis B nukleat baik tikus dan manusia, dan saat ini dalam uji klinis (Mumper, 2001).

Bagaimana Gene Gun bekerja?? Senapan gen merupakan bagian dari metode yang disebut metode biolistic (juga dikenal sebagai bioballistic), dan dalam kondisi tertentu, DNA (atau RNA) menjadi "lengket," mengikuti lembam biologis partikel seperti atom logam ( biasanya tungsten atau emas). Dengan mempercepat kompleks DNA-partikel dalam vakum parsial dan menempatkan jaringan target dalam jalur percepatan, DNA efektif diperkenalkan (Gan, 1989). partikel logam tidak dilapisi juga bisa menembak melalui DNA larutan yang mengandung sekitar sel sehingga mengambil bahan genetik dan melanjutkan ke dalam sel hidup. Sebuah piring berhenti cartridge shell namun memungkinkan potongan logam untuk melewati dan masuk ke sel-sel hidup di sisi lain. Sel-sel yang mengambil DNA yang diinginkan, yang diidentifikasi melalui penggunaan gen penanda (pada tanaman penggunaan GUS paling umum), kemudian dibudidayakan untuk meniru gen dan mungkin kloning. Metode biolistic yang paling berguna untuk memasukkan gen ke dalam sel tanaman seperti pestisida atau herbisida perlawanan. Berbagai metode telah digunakan untuk mempercepat partikel: ini termasuk perangkat pneumatik, instrumen menggunakan dorongan mekanis atau macroprojectile; kekuatan sentripetal, magnetis atau elektrostatik; spray atau vaksinasi senjata, dan aparat berdasarkan percepatan oleh gelombang kejut, seperti mengalirkan listrik (christou dan McCabe, 1992).

Atas kiri: partikel emas yang digunakan dalam pistol gen. Atas kanan: partikel tungsten digunakan dalam pistol gen.

Atas: Sketsa bagaimana helium genggam pistol gen powered bekerja dengan mendorong partikel dilapisi DNA ke dalam jaringan. (Gambar dari Williams, 1991)

Ada beberapa variabel dalam percobaan yang harus dikontrol dalam rangka mencapai efisiensi transformasi maksimal. respon optimal telah terbukti tergantung pada pengiriman dalam jumlah yang memadai partikel DNA-dilapisi, serta bagaimana mantel DNA banyak partikel logam (Eisenbraun, 1993). Suhu, jumlah sel, dan kemampuan mereka untuk regenerasi juga memiliki efek pada efisiensi keseluruhan, serta jenis senjata yang digunakan: helium powered vs senapan-bubuk, dipegang tangan vs yang berdiri sendiri, dll Adalah juga penting untuk menyesuaikan panjang jalur penerbangan dari partikel: jaringan rapuh tidak dapat dibombardir dengan kecepatan tinggi yang sama seperti mereka yang memiliki ketahanan lebih untuk partikel asing yang memasuki. Bagaimana untuk menyesuaikan variabel-variabel ini terutama tergantung pada dimana logam partikel yang Anda gunakan untuk mentransfer materi genetik, dan apa jenis sel yang sedang berusaha untuk transfect.

Signifikansi: Penggunaan lain yang penting dari pistol DNA melibatkan transformasi organel seperti yang disebutkan di atas: kloroplas, serta ragi mitokondria. Kemampuan untuk mengubah organel ini penting karena memungkinkan peneliti untuk insinyur herbisida organel-encode atau resistensi pestisida dalam tanaman dan mempelajari proses fotosintesis. pengiriman DNA dengan pistol gen juga menawarkan keuntungan baru untuk penelitian di bidang-bidang seperti vaksinasi DNA / imunisasi genetik, terapi gen, biologi tumor / penyembuhan luka, virologi tanaman dan banyak lainnya.

Keterbatasan utama adalah penetrasi dangkal partikel, terkait kerusakan sel, ketidakmampuan untuk memberikan DNA sistemik, jaringan untuk menggabungkan DNA harus mampu regenerasi, dan peralatan itu sendiri sangat mahal. Keberatan dengan metode ini adalah bahwa DNA dapat dimasukkan ke dalam gen yang bekerja di pabrik dan banyak kekhawatiran publik bahwa DNA baru kemudian bisa ditransfer ke tanaman liar juga dan perlawanan bisa diberikan untuk gulma atau serangga. (ThinkQuest)

Definisi:
Transfeksi: proses memperkenalkan telanjang molekul DNA ke dalam sel. Ini adalah salah satu teknik yang paling sering digunakan dalam biologi molekular. Transfeksi sel biasanya dicapai dalam salah satu dari tiga metode dasar. metode kimia transfeksi termasuk fosfat kalsium atau lipofection. metode fisik termasuk elektroporasi atau pistol gen. Selain itu, transfer gen juga dapat dimediasi dengan efisiensi tinggi oleh virus seperti adenovirus atau retrovirus.

Transformasi (berkenaan dengan bakteri): Proses di mana bakteri memperoleh plasmid. Istilah ini paling sering merujuk pada prosedur bangku yang dilakukan oleh eksperimen yang memperkenalkan percobaan ke dalam plasmid bakteri.

Plasmid: Sepotong melingkar yang hadir DNA pada bakteri atau terisolasi dari bakteri. E. coli memiliki genom lingkaran besar, tetapi juga akan mereplikasi DNA melingkar kecil selama mereka memiliki asal replikasi. Plasmid mungkin memiliki DNA lain yang disisipkan oleh eksperimen. Sebuah bakteri yang membawa plasmid dan mereplikasi satu juta kali lipat akan menghasilkan satu juta salinan plasmid yang identik.

transfeksi Transient: Ketika DNA transfected ke dalam sel budidaya, ia mampu tinggal di sel-sel selama sekitar 2-3 hari, tetapi kemudian akan hilang. Selama 2-3 hari, DNA fungsional, dan setiap gen fungsional yang dikandungnya akan dinyatakan. Peneliti mengambil keuntungan dari periode ini ekspresi transien untuk menguji fungsi gen.

Stabil transfeksi: Suatu bentuk transfeksi percobaan yang dirancang untuk menghasilkan garis permanen sel kultur dengan gen baru dimasukkan ke dalam genom mereka. Biasanya ini dilakukan dengan menghubungkan gen yang diinginkan dengan gen dipilih yang kemudian digunakan untuk menentukan mana sel-sel telah diambil gen eksperimen tentang bunga. (Lyons)

Simak

Baca secara fonetik

References:
1. Clough SJ and Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16(6): 735-743.
2. Zhang et al. (2006) Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc 1(2): 641-646.
3. Chung et al. (2000) Floral spray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenic plants. Transgenic Res 9(6): 471-476.
4. - Christou, Paul; McCabe, Dennis. Particle Gun Transformation of Crop Plants Using Electric Discharge (ACCELL™ Technology).  Agracetus Inc., Middleton, WI; 1992.
- Eisenbraun MD, Fuller DH, Haynes JR. "Examination of parameters affecting the elicitation of humoral immune responses by particle bombardment-mediated genetic immunization. DNA Cell Biology; Nov., 1993, (9):791-7
- Gan, Carol.  "Gene Gun Accelerates DNA-Coated Particles To Transform Intact Cells".  The Scientist; Sep. 18, 1989, 3[18]:25.
- Helenius, Elina; Boije, Maria; Niklander-Teeri, Viola; Palva, E. Tapio; Heeri, Teemu U. "Gene Delivery Into Intact Plants Using the Helios Gene Gun".  Plant Molecular Biology Reporter; 2000, 18: 287a-2871.
- Lyons, Robert H. A Molecular Biology Glossary. University of Michigan, July 1998.
- Mumper RJ, Ledebur Jr HC. "Dendritic cell delivery of plasmid DNA. Applications for controlled genetic immunization."
Molecular Biotechnology: 2001, 19:79-95
- Oulu University Library. Surgical organ perfusion method for somatic gene transfer: An experimental study on gene transfer into the kidney, spleen, lung and mammary gland. 2000, Review of the literature.
- Williams, R. Sanders; Johnston, Stephen A; Riedy, Mark; DeVit, Michael J; McElligott, Sandra G.; Sanford, John C. "Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles." Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; Apr, 1991, 1;88(7):2726-30.
- Wetterauer, Birgit; Salger, Klaus; Demel, Petra; and Koop, Hans-Ulrich. "Transformation of Dictyostelium discoideum with a Particle Gun."  Biochim Biophys Acta; Dec 11, 2000, 1499(1-2):139-143.
- Yang NS, Burkholder J, Roberts B, Martinell B, McCabe D. "In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment." Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA; 1990, 87:9568-9672.

Read More